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            直播答疑 | 懸浮細胞培養要點解析

            更新時間:2023-11-28  |  點擊率:345


            11月16日,普諾賽直播間為大家介紹了懸浮細胞的生長特點、培養注意事項,并通過THP-1、NK-92、NCI-H209三個細胞案例,深入講解了懸浮細胞的培養要點。直播回放可移步至B站-“普諾賽生物"進行觀看。本期直播答疑,從直播間提問中,篩選出部分有代表性的問題,做了詳細解答。


            如有其他問題,也歡迎大家在推文底部留言,我們將在線解答。



            Q1

            傳代時,細胞密度比較低,但是培養基又

            變黃了,怎么辦?

            細胞培養過程中,如發現細胞量較少,但培養基變黃較快,可以從以下3個方面進行排查:


            ? 檢查培養基成分是否正常,如NaHCO3濃度是否偏低;


            ? 檢查培養箱內CO2濃度是否過高,一般培養基添加濃度為1.5g/L或2.2g/L的NaHCO3,使用5% CO2進行平衡;添加濃度為3.7g/L的NaHCO3可使用10% CO2進行平衡;


            ? 是否存在某種污染物,與細胞競爭營養,導致培養基快速消耗。一般先排除細菌和真菌污染,通過培養法檢查即可(不加抗生素培養檢查),如排除細菌和真菌污染,可進行支原體檢測,確定是否存在支原體污染。

            Q2

            半換液算傳代嗎?怎么計算代數?

            對于有限傳代的細胞,細胞的代次可以用以下公式進行計算

            PDL =X+3.322(log Y – log I) 

            其中X為傳代前代次 ; I 為細胞接種前細胞數;Y 為培養后細胞總數


            對于腫瘤細胞或無限傳代的細胞,傳代數僅僅代表操作的次數,與傳代比例和細胞增殖數量沒有直接關系;


            半量換液的細胞,如果沒有進行分瓶培養,建議按照常規的換液來計算,不計入傳代次數,如加入新鮮培養基后分瓶培養,則可以將傳代數+1。

            Q3

            本來成團生長的細胞,不成團了怎么辦?

            細胞是否成團生長,一般是跟細胞本身特性以及培養環境有關的。


            如果是本來成團生長的細胞,分散不成團,且增殖速度變慢,可能是細胞狀態變差的癥狀。一般可以從是否污染(特別注意支原體檢查)、細胞培養基或血清是否變更以及操作過程是否對細胞產生損傷這三個方面進行排查。


            如果細胞僅僅是變成分散狀態,但是生長指標都正常,則可能是由于培養條件或環境改變導致的,只要細胞生長正常且沒有其他異常癥狀,不需要過度關注。

            Q4

            懸浮細胞復蘇4-5天進行凍存會影響

            細胞活率嗎?

            細胞是否適合凍存取決于細胞的生長狀態,用于凍存的細胞一般要求狀態良好,并處于快速增殖階段。


            對于生長速度較快的懸浮細胞,4-5天可以傳代1-2次,狀態基本恢復,保證細胞處于生長旺盛的對數生長期即可凍存;


            但是對于生長速度慢的細胞,4-5天細胞可能還處于狀態恢復中,沒有大量增殖,此時凍存可能會影響后續復蘇的狀態。建議復蘇后的細胞,培養1-2代,細胞狀態良好時進行凍存。

            Q5

            培養THP-1細胞兩周,培養液很容

            黃,聚團很嚴重,中間有黑渣渣,怎么辦?

            如果細胞量沒有明顯增加,培養基很容易變黃,黑點多且細胞聚團嚴重,懷疑細胞是存在某種污染,需要排除污染源后重新培養。

            Q6

            THP-1有少量貼壁細胞怎么處理?

            如果出現少量貼壁,每次傳代培養時,只收集懸浮部分即可;如果需要完-全不貼壁,可以選擇低吸附的培養瓶進行培養。

            Q7

            培養幾天后,懸浮細胞的培養基是不是

            會變渾濁些?

            懸浮細胞和貼壁細胞不一樣,培養上清是略顯渾濁的,隨著細胞量的增加渾濁度也會增加。


            可以通過鏡檢結果來與細菌等污染物進行區分,鏡檢細胞懸液,細胞間隙應該是干凈的,但污染的細胞間隙一般是大量黑色顆粒,有些可以觀察到明顯的運動。

            Q8

            THP -1細胞量挺多,但培養基長時間不

            變黃,有什么辦法?

            培養基是否變黃只是細胞傳代的參考指標。培養基變黃主要是細胞代謝產物積累導致,同時也會受到培養基的緩沖體系以及培養箱CO2濃度的影響。如果細胞生長正常,并且到了傳代的量,則可以正常傳代。


            對于THP-1細胞來說,如果細胞數量足夠但是培養基不變黃,可能是由于細胞接種時培養基pH值偏高(可能是培養基開啟時間過長,CO2溢出導致的pH值升高),細胞數量雖多但沒有明顯代謝和增殖,所以顏色不容易變黃。所以建議不要直接分瓶,可以換用新鮮培養基繼續觀察。

            Q9

            Sf9細胞靜置培養時正常,轉入搖瓶懸浮

            培養,停滯不長,但也沒死,是培養基不

            適合懸浮培養嗎?

            細胞培養條件的變更,如更換培養基,或者由靜置培養轉為搖瓶培養,都需要一個馴化和適應的過程。


            馴化過程,簡單說就是緩慢更換培養條件,如將新舊培養基按比例混合,讓細胞逐步適應,或者在搖瓶培養前期,調低搖床轉速,讓細胞逐漸適應。將細胞直接轉入新的培養基或培養環境可能導致細胞不長甚至死亡的情況。



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